AN OVERVIEW ON THE PHYLOGENETIC CLASSIFICATION OF Brucella / EVOLUCIÓN EN LA CLASIFICACIÓN FILOGENÉTICA DE Brucella

SUMMARY The genus Brucella is a globally distributed intracellular pathogen that affects animals and humans and presents low genetic variability, which is a challenge for its phylogenetic reconstruction. Genus differentiation originally occurred due to its preference for a certain host and analyses throughout the years to classify the genus Brucella and its strains, depended on the techniques used, the number of strains or the methods of phylogenetic reconstruction. Its history goes from recognizing the entire genus as unique B. mellitensis species with multiple varieties, to recognizing more than ten species. This review shows the journey through the techniques that have been used to differentiate the genus Brucella, which, although they have generated clarity in the grouping of some species, still leaves doubts in related to the oldest species, their divergence and the type of grouping of the new species discovered. The application of new technologies such as phylogenomics is contributing to solve these questions.

RESUMEN Las especies del género Brucella son patógenos de distribución mundial que afecta, tanto a los animales como al hombre, los cuales, presentan baja variabilidad genética, convirtiéndolo en un reto para su reconstrucción filogenética y diferenciación. La diferenciación originalmente se dio, debido a su preferencia por cierto hospedero. A través de los años, se han realizado diferentes análisis para clasificar el género Brucella y las variaciones que presenta, que dependen de las técnicas empleadas para su clasificación, las especies, el número de cepas o los métodos de reconstrucción filogenética. La historia pasa desde reconocer a todo el género como una única especie B. mellitensis con múltiples variedades, a reconocer más de diez especies. En esta revisión, se hace una travesía, a través de las diferentes técnicas que se han utilizado en el tiempo, para clasificar el género Brucella que, aunque han generado claridad en el agrupamiento de algunas especies, aun dejan dudas en relación a las especies más antiguas, su divergencia y el tipo de agrupación de las nuevas especies descubiertas. La aplicación de nuevas tecnologías, como la filogenómica, está contribuyendo a resolver estos interrogantes.

Sub-Acute Ruminal Acidosis and non-structural carbohydrates: a study model in nutritional immunology / Acidosis Ruminal Sub-Aguda y carbohidratos no estructurales: un modelo de estudio en inmunología nutricional / Acidose ruminal subaguda e carboidratos não estruturais: um modelo de estudo em imunologia nutricional

Nutritional immunology combines two areas of knowledge that did not interact until recently. One of the best examples studied to date is the bovine rumen. The symbiotic relationship between the host and rumen microorganisms can be altered causing a breakdown of immunological tolerance and imbalance of animal homeostasis. Dietary inclusion of supplements rich in non-structural carbohydrates is required for high yielding cows to meet their energy requirements. However, the use of those diets can lead to substantial changes in the rumen ecosystem, reducing the pH and promoting the development of subacute rumen acidosis. This generates lysis of gram-negative bacteria, release of lipopolysaccharides, breaking of immune tolerance, and activation of a cascade of inflammatory mediators with systemic effects that affect milk yield and quality. The gastrointestinal tract is the most important place where lipopolysaccharides are produced and its translocation mechanism from the rumen to peripheral circulation is still controversial. This review proposes a biological model integrating nutritional and immunological aspects of production, absorption, and mechanisms of action of lipopolysaccharides and its effects on milk production and compositional quality.

La inmunología nutricional combina dos áreas del conocimiento que no interactuaban hasta hace algunos años. Uno de los mejores ejemplos estudiados hasta la fecha lo constituye el rumen bovino. La relación simbiótica entre hospedero y microorganismos ruminales puede alterarse provocando una ruptura de la tolerancia inmunológica y un desequilibrio en la homeostasis del animal. Para cubrir los requerimientos energéticos de las vacas de alta producción lechera es necesario incluir en la alimentación suplementos de elevado contenido en carbohidratos no estructurales. Sin embargo, el uso de estas dietas puede provocar cambios sustanciales en el ecosistema ruminal, disminuyendo el pH y promoviendo el desarrollo de acidosis ruminal subaguda. Esto genera la lisis celular de las bacterias gram negativas, la liberación de lipopolisacáridos, la ruptura de la tolerancia inmunológica y la activación de una cascada de mediadores inflamatorios que tienen consecuencias sistémicas y afectan el rendimiento productivo del animal y la calidad composicional de la leche. El tracto gastrointestinal es el lugar más importante donde se producen los lipopolisacáridos, pero el mecanismo de translocación del rumen a la circulación periférica es aún controversial. En esta revisión de literatura se propone un modelo biológico que integra aspectos nutricionales e inmunológicos relacionados con la producción, absorción y mecanismos de acción de los lipopolisacáridos y los efectos sobre la producción y la calidad composicional de la leche.

A imunologia nutricional combina duas áreas de conhecimento que não interagiam até alguns anos atrás. Um dos melhores exemplos estudados até o presente consiste no rúmen bovino. A relação simbiótica entre hospedeiro e microrganismos do rúmen pode ser alterada causando uma quebra da tolerância imune e um desequilíbrio na homeostase do animal. Para satisfazer as necessidades energéticas de vacas de alta produção leiteira é necessário fornecer suplementos alimentares de elevado conteúdo em carboidratos não estruturais. No entanto, o uso dessas dietas pode provocar alterações importantes no ecossistema ruminal, reduzindo o pH e promovendo o desenvolvimento de acidose ruminal subaguda. Isto gera a lise de bactérias gram-negativas, a liberação de lipopolissacarídeos, a quebra da tolerância imune e a activação de uma cascata de mediadores inflamatórios que têm efeitos sistémicos e afetam o desempenho produtivo do animal e a composição do leite. O trato gastrointestinal é o lugar mais importante na produção dos lipopolissacarídeos, mas o mecanismo de translocação do rúmen para a circulação periférica é ainda controversa. Nesta revisão de literatura se propõe um modelo biológico que integra aspectos nutricionais e imunológicos relacionados com a produção, absorção e mecanismos de ação de os lipopolissacarídeos e os efeitos sobre a produção e composição do leite.

Evaluation of screening tests for antimicrobial residues in milk from individual cows treated with a combination of penicillins G and streptomycin / Valoración de pruebas de campo para detección rápida de residuos antimicrobianos en leche individual de vacas tratadas con una combinación de penicilinas y estreptomicina / Valoração de testes de campo para detecção rápida de resíduos antimicrobianos em leite individual de vacas tratadas com uma mistura de penicilinas e estreptomicina

Abstract Background: in Colombia, the law (Resolution 1382, 2013) prohibits the sale of milk that contains any antimicrobial drug residues, although no specific official screening tests and detection limits have been specified. At present, milk with positive results to both the Delvotest® and Snap® assays is simply rejected. To avoid contaminating bulk tanks with milk from individually treated cows, producers would benefit from having on-farm screening tests to conduct their own quality controls. In addition, on-site testing would allow farmers to check if the withdrawal times of commercially-available generic products are in accordance with labeled recommendations. Material and Methods: In this study, two commonly used rapid detection tests (Delvotest® and SNAP® specific for beta-lactams) were used on milk from 39 subclinical mastitic Holstein cows that were prescribed with daily intramuscular injections of a commercial suspension containing 8.000.000 IU of penicilin G (75% procaine penicilin G, 25% potasium penicillin) and 8 g of streptomycin sulfate, for a total of 4 days. Cows were individually milked and samples collected every 12 hours the day before, and for 3 days after the recommended withdrawal time of three days post-treatment. To inactivate the potential action of natural inhibitors of microbial growth that may be present in milk (ie., lysozyme and lactoferrin), the results of the Delvotest® were compared before and after milk samples were subjected to heat treatment (82°C for 5 minutes). Results: When the Delvotest® was used as per manufacturer's instructions (i.e., without heating), 7 of 39 cows were positive for one more day past the recommended withdrawal period. However, the results of the Snap® specific for beta-lactams and Delvotest® post-heating showed that only 2 of those 7 cows were positive, suggesting that 5 animals gave false positive results. For the 312 milk samples analyzed, a high degree of concordance was observed (Kappa coefficient=0.74±0.1) between the Snap® and Delvotest® post-heating. Conclusions: Considering that the streptomycin in this product is known to be eliminated faster than penicillin-G, the results suggest that the efficacy of the Delvotest® (after heat treatment) is similar to that of the Snap® beta-lactams for the detection of penicillin residues. However, when the Delvotest® was not preceded by heat treatment to inactivate potential natural inhibitors, it yielded a high number of false-positive results. The results also showed that in 95% (37/39) of the cows treated with this commercial product, the labeled instructions of a 3 day withdrawal period were adequate for compliance within the law.

Resumen En Colombia, la ley (Resolución 1382, 2013) prohíbe la venta de leche que contenga residuos de cualquier medicamento antimicrobiano, aunque no se especifican pruebas oficiales ni límites de detección que deban cumplir. Actualmente, la leche que emite resultados positivos a los kits del Delvotest® y Snap® simplemente es rechazada. Para evitar contaminar tanques de acopio con leche de vacas tratadas, los productores se beneficiarían de tener pruebas in situ que les permitan hacer sus propios controles. Además, ello permitiría comprobar si los tiempos de descarte de productos comerciales cumplen con las recomendaciones de los insertos. En este estudio se evaluaron dos pruebas de detección rápida (Delvotest® y SNAP® específico parar beta-lactámicos) en leche de 39 vacas con mastitis subclínica que fueron tratadas con inyecciones diarias intramusculares de una suspensión comercial de 8.000.000 UI de penicilina G (75% penicilina procaínica G, 25% penicilina potásica) y 8 g de sulfato de estreptomicina, durante 4 días. Las vacas se ordeñaron manualmente y recolectaron muestras de leche, cada 12 horas, por 1 día antes y 3 después del tiempo de retiro recomendable de 3 días post-tratamiento. Para inactivar la acción de inhibidores naturales del crecimiento bacteriano que pueden estar presentes en leche (ej, lisozima y lactoferrina), los resultados del Delvotest® se compararon antes y después de que las muestras de leche fuesen sometidas a calentamiento (82°C por 5 minutos). Cuando el Delvotest® se usó de acuerdo a las instrucciones de la compañía, es decir, sin calentamiento, 7 de 39 vacas dieron positivas por ≥ 1 días pasado el tiempo de retiro recomendado. Sin embargo, los resultados del Snap® y Delvotest® post-calentamiento mostraron que sólo 2 de las 7 vacas eran positivas, sugiriendo que 5 animales estaban dando falsos positivos. En las 312 muestras de leche analizadas se obtuvo un alto grado de concordancia (coeficiente Kappa = 0.74±0.1) entre el Snap® y el Delvotest® post-calentamiento. En conclusión, los resultados sugieren que la eficacia del Delvotest® (post-calentamiento) es similar a la del Snap® específico para beta-lactámicos en lo que respecta a detección de residuos de penicilina. Sin embargo, cuando el Delvotest® no iba precedido de calentamiento para inactivar inhibidores naturales, se produjeron demasiados falsos positivos. Los resultados también mostraron que en el 95% (37/39) de las vacas tratadas con este producto, la recomendación de descarte por 3 días cumplía con la legislación vigente de no contener residuos.

Resumo Na Colômbia, a lei (Resolução 1382 de 2013) proíbe a venda do leite que tenha resíduos de qualquer medicamento antimicrobiano, embora não se especifiquem testes oficiais nem limites de detecção que devam se cumprir. Atualmente, o leite que emite resultados positivos aos Kits de Delvotest® e Snap® simplesmente é rejeitado. Para evitar contaminar os tanques de armazenamento com leite de vacas tratadas, os produtores beneficiar-se-iam de ter os testes in situ que lhes permita fazer seus próprios controles. Além, isto permitiria comprovar se os tempos de retiro do leite ao utilizar produtos comerciais cumprem com as recomendações da vide bula. Neste estudo avaliaram-se dois testes de detecção rápida (Delvotest® e SNAP® especifico parar beta-lactâmicos) no leite de 39 vacas com mastite subclínica que foram tratadas com injeções diárias intramusculares de uma suspensão comercial de 8.000.000 UI de penicilina G (75% penicilina procaína G, 25% penicilina potássica) e 8g de sulfato de estreptomicina durante quatro dias. Extraiu-se o leite das vacas com ordenha manual e se fez uma amostragem de leite (cada 12 horas) um dia antes e três dias depois do tempo de retiro do leite, que tinha como recomendável, na vide bula, três dias após final do tratamento. Para inativar a ação de inibidores naturais do crescimento bacteriano, que possam estar presentes no leite (ex. lisozima e lactoferrina), os resultados do Delvotest® compararam-se antes e depois de que as amostras de leite fossem sometidas a aquecimento (82°C durante 5 minutos). Quando o Delvotest® usou-se de acordo com as instruções da companhia, quer dizer, sem aquecimento, sete das 39 vacas deram positivas por ≥ 1 dia passado o tempo de retiro recomendado. Embora, os resultados do Snap® e Delvotest® após aquecimento do leite mostraram que só dois das sete vacas eram positivas, sugerindo que cinco animais estavam apresentando falsos positivos. Nas 312 amostras de leite analisadas obteve-se um alto grau de concordância (coeficiente Kappa = 0.74±0.1) entre o Snap® e o Delvotest® após aquecer o leite. Em conclusão, os resultados sugerem que a eficácia do Delvotest® (após o aquecimento do leite) é similar á do Snap ou especifico para beta-lactâmicos no que respeita a detecção de resíduos de penicilina. Embora, quando o Delvotest® não ia precedido do aquecimento do leite para inativar inibidores naturais, produziram-se muitos falsos positivos. Os resultados também demonstraram que o 95% (37/39) das vacas tratadas com este produto, estavam de acordo com a recomendação de descarte por três dias e cumpria com a legislação vigente de não conter resíduos.

Distribution of conjugated linoleic acid (CLA) isomers and other fatty acids in polar and neutral fractions of milk from cows fed different lipid supplements / Distribución de isómeros de ácido linoléico conjugado (CLA) y ácidos grasos en las fracciones neutra y polar de la leche de vacas alimentadas con diferentes suplementos lipídicos / Distribuição de isômeros do acido linoleico conjugado (CLA) e outros ácidos graxos nas frações polares e neutras no leite de vacas alimentadas com diferentes suplementos lipídicos

Background: milk fatty acid composition has become very important for consumers due to the positive relationship that has been found between some fatty acids and human health. In recent years, content and fatty acid composition in the different fractions of milk lipids has also become important due to reported potential technological and sensory implications. Objective: the aim of this study was to evaluate the effect of dietary supplementation with several lipid supplements on the proportion of neutral (triglycerides) and polar lipids (phospholipids) of milk fat, alterations of the fatty acid composition and Conjugated Linolenic Acid isomers (CLA) of total milk lipids. Methods: 18 first lactation German Holstein cows were assigned to three dietary treatments for 10 weeks as follows: Rumen-stable fractionated palm fat, linseed oil plus algae, and sunflower oil plus algae. Results: dietary polyunsaturated fat supplements increased the proportion of phospholipids and decreased triglycerides in milk fat compared to Rumen-stable fractionated palm fat. Long chain polyunsaturated fatty acids were preferentially deposited into phospholipids. Diet effect was more pronounced in triglycerides than in phospholipids. Plant oil/algae supplemented diets induced lower proportions of total saturated fatty acids and higher proportions of total unsaturated fatty acids in triglycerides. Conclusions: linseed oil plus algae feeding generated the best results in reference to fatty acids related to human health. Sunflower oil plus algae caused accumulation of CLAtrans-10,cis-12, CLAtrans-7,cis-9, CLAtrans-7,trans-9 and CLAtrans-10,trans-12 and decrease of CLAtrans-9,trans-11 in total milk fat, whereas linseed oil plus algae increased CLAtrans-12,trans-14, CLAtrans-11,trans-13, and CLAtrans-11,cis-13 deposition compared to rumen-stable fractionated palm fat.

Antecedentes: la composición de ácidos grasos de la leche ha tomado gran importancia para los consumidores a causa de la relación positiva que se ha encontrado entre algunos ácidos grasos y la salud humana. En los últimos años, el contenido y composición de ácidos grasos en las diferentes fracciones de los lípidos de la leche también ha tomado importancia debido a las posibles implicaciones tecnológicas y sensoriales que se han reportado. Objetivo: el objetivo del presente estudio fue evaluar los cambios en la proporción de lípidos neutros (triglicéridos) y lípidos polares (fosfolípidos) y alteraciones de la composición de ácidos grasos e isómeros del Ácido Linoléico Conjugado (CLA) del total de lípidos de la leche como resultado de la suplementación dietaria con diferentes suplementos lipídicos. Métodos: 18 vacas Holstein Alemán de primera lactancia fueron asignadas a tres tratamientos dietarios durante 10 semanas, así: grasa de palma fraccionada y estable al rumen, aceite de lino más alga, y aceite de girasol más alga. Resultados: la suplementación con ácidos grasos poliinsaturados incrementó la proporción de fosfolípidos y disminuyó la de triglicéridos en la grasa de la leche comparado con grasa de palma fraccionada y estable al rumen. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga fueron preferencialmente depositados en los fosfolípidos. El efecto de la dieta fue más pronunciado en los triglicéridos que en los fosfolípidos. Las dietas suplementadas con aceite vegetal y alga indujeron a menores proporciones de ácidos grasos saturados y mayores proporciones de ácidos grasos insaturados en los triglicéridos. Conclusiones: la suplementación con aceite de lino más alga generó los mejores resultados respecto a la composición de ácidos grasos relacionados con la salud humana. El aceite de girasol más alga causó una acumulación de isomeros CLAtrans-10,cis-12, CLAtrans-7,cis-9, CLAtrans- 7,trans-9 y CLAtrans-10,trans-12 y disminuyó CLAtrans-9,trans-11 en la grasa total de la leche mientras que el aceite de lino más alga incrementó CLAtrans-12,trans-14, CLAtrans-11,trans-13, y CLAtrans-11,cis-13 comparado con la grasa de palma fraccionada y estable al rumen.

Antecedentes: a composição de ácidos graxos do leite tem-se tornado muito importante para os consumidores devido à relação positiva encontrada entre alguns ácidos graxos e a saúde humana. Nos últimos anos, o conteúdo e composição dos ácidos graxos nas diferentes frações lipídicas no leite também se tornaram importantes devido às consequências tecnológicas e sensoriais que tem sido reportada recentemente. Objetivo: realizou-se um estudo para avaliar as mudanças na proporção de lipídios neutros (triglicerídeos) e polares (fosfolipídios) na gordura do leite e as alterações da composição dos ácidos graxos e os isômeros do Ácido Linoleico Conjugado (CLA) no total dos lipídeos do leite como resultado da suplementação na dieta com diferentes suplementos lipídeos. Métodos: 18 vacas Holandesas na Alemanha, todas de primeira lactação foram avaliadas em três tratamentos com regimes alimentares diferentes durante 10 semanas, assim: óleo de palma fracionada e estável no rúmen, óleo de linhaça mais algas e óleo de girassol mais algas. Resultados: a suplementação com ácidos graxos poli-insaturados incrementou a proporção de fosfolipídios e diminuiu a proporção de triglicerídeos na gordura do leite, comparado com o óleo de palma fracionada e estável no rúmen. Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa foram preferencialmente depositados nos fosfolipídios. O efeito da dieta foi mais pronunciado nos triglicerídeos que nos fosfolipídios. As dietas que foram suplementadas com óleo vegetal mais algas reduziram a proporção de ácidos graxos saturados, e aumentaram a proporção de ácidos graxos insaturados nos triglicerídeos. Conclusões: a suplementação com óleo de linhaça mais alga gerou os melhores resultados respeito à composição dos ácidos graxos relacionados com a saúde humana. O óleo de girassol mais alga causaram uma acumulação de CLAtrans-10, cis-12, CLAtrans-7, cis-9, CLAtrans-7, trans-9 e CLAtrans-10, trans-12 e diminuiu CLAtrans-9, trans-11 na gordura total do leite, enquanto que óleo de linhaça mais alga aumentou a deposição de CLAtrans-12, trans-14, CLAtrans-11, trans-13, e CLAtrans-11, cis-13, em comparação com o óleo de palma fracionada e estável no rúmen.

Reducción de la biohidrogenación del ácido linoleico y alfa linolénico por la adición de diferentes proporciones de ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico / Reduction of the biohydrogenation of linoleic and alpha-linolenic acid by addition of different proportions of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid / Redução da bio-hidrogenação do ácido linoleico e alfa-linolênico pela adição de diferentes proporções de ácido eicosapentaenóico e docosahexaenóico

Se evaluó el efecto de la adición de ácido docosahexaenoicoe (DHA) y eicosapentaenocio (EPA) a una mezcla de ácido linoleico (ALi) y alfa-linolénico (ALn), sobre su biohidrogenación, en fluido ruminal in vitro. A 500 mg de kikuyo, se agregaron 18 μL de una mezcla de ALi:ALn (75:25) (Control) o una mezcla de 14,9 μL ALi:ALn (75:25) con 3,1 μL de una mezcla que contenía cuatro relaciones de DHA:EPA (100:0, 75:25, 25:75, 0:100). El kikuyo sin adición de ácidos grasos (AG) (Control negativo) o con adición de estos, fue incubado con fluido ruminal por triplicado, durante 0, 5 o 16 horas, en tubos de 50 mL. Los lípidos del material incubado fueron extraídos, metilados y analizados para AG por CG-FID. Las concentraciones relativas (g/100 g AG) de los AG incubados y los principales productos de la isomerización y biohidrogenación se compararon mediante un modelo completamente al azar, usando el PROC GLM de SAS. La concentración relativa de ALi y ALn disminuyó con el tiempo de incubación, pero no fue diferente entre tratamientos con EPA y DHA a las 16 horas. La adición de DHA y EPA puros o en mezclas disminuyó la concentración relativa de C18:0 (P < 0,01) e incrementó la de C18:1 trans-11 (ATV) (P < 0,01) y C18:2 trans-11, cis-15 (P < 0,01) (ALC), mientras que los cambios en la concentración relativa del C18:2 cis-9, trans-11 no fueron claros. Los resultados sugieren que la acción inhibitoria del EPA y DHA ocurre en los pasos finales de la biohidrogenación del ALi y del ALn.

The effect of adding docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) on the in vitro biohydrogenation of linoleic (ALi) and alpha-linolenic acid (ALn) using ruminal fluid was evaluated. To 500 mg of kikuyo, 18 μL of a mixture of ALi:ALn (75:25) (Control) or a mixture of 14,9 μL ALi:ALn (75:25) and 3,1 μL of a mixture containing four ratios of EPA:DHA (100:0, 75:25, 25:75, 0:100) were added. In 50 mL tubes, kikuyo without fatty acids (FA) (negative control) or with their addition was incubated with ruminal fluid by triplicate during 0, 5 or 16 hours. Lipids in the incubated material were extracted, methylated and fatty acids were quantified by GC-FID. Relative concentrations (g/100 g FA) of incubated fatty acids and their main isomerization and ruminal biohydrogenation products were compared by a completely randomized model using PROC GLM of SAS. The relative concentration of ALi and ALn decreased with incubation time but was not different between EPA and DHA treatments at 16 hours. Addition of EPA and DHA, pure or in mixtures, decreased the relative concentration of C18:0 and increased the relative concentration of C18:1 trans-11 (TVA) (P<0,01 ) and C18:2 trans-11, cis-15 (P<0,01), while changes in the relative concentration of C18:2 cis-9, trans-11 (CLA) were not clear. Our results suggest that EPA and DHA inhibit the final steps of ruminal biohydrogenation of ALi and ALn.

Foi avaliado o efeito da adição do ácido docosahexaenóico (DHA) e eicosapentaenóico (EPA) a uma mistura de ácido linoleico (ALi) e linolênico (ALn) sobre à sua biohidrogenação, em fluido ruminal in vitro. Foram adicionados, a 500 mg de kikuio, 18 μL de uma mistura de ALi:ALn (75:25) (Controle) ou uma mistura de 14,9 μL ALi:ALn (75:25) com 3,1 μL de quatro relações de EPA:DHA (100:0, 75:25, 25:75, 0:100). O kikuio sem adição de ácidos graxos (AG) (Controle negativo) ou com adição destes foi incubado com fluido ruminal por triplicata durante 0, 5 ou 16 horas, em tubos de 50 mL. Os lipídeos do material incubado foram extraídos, metilados e analisados para AG por CG-FID. As concentrações relativas (g/100 g AG) dos AG incubados e dos principais produtos da isomerizacão e biohidrogenação ruminal foram comparados por meio de um modelo completamente ao acaso, utilizando o PROC GLM do SAS. A concentração relativa de ALi e ALn diminuiu com o tempo de incubação, mas não foi diferente entre tratamentos com EPA e DHA às 16 horas. A adição de EPA e DHA puros ou em misturas diminuiu a concentração relativa de C18:0 e incremento ua presencia da C18:1 trans-11 (ATV) (P<0,01) e C18:2 trans-11, cis-15 (P<0,01), en quanto que a concentração relativa do C18:2 cis-9, trans-11 (ALC) a presentou um comportamento errático. Os resultados sugerem que a adição inibitória do EPA e DHA acontece nos estágios finais da biohidrogenação ruminal de ALi e ALn.

Identification of Brucella canis Group 2 in colombian kennels / Identificación de Brucella canis Grupo 2 en criaderos de perros en Colombia / Identificação de Brucella canis Grupo 2 em criadouros de cães na Colômbia

Background: recently, isolates of Brucella canis (B. canis ) were classified into two groups, Group 1 and Group 2, based on a 794 bp deletion in the polysaccharide deacetylase gene in Group 1, or absence of this deletion in Group 2. In Colombia, B. canis was first isolated from sick or clinically healthy seropositive dogs in 2005. Objective: to determine Brucella canis genotype in isolates from Medellín Metropolitan Area. Methods: 49 isolates from a study involving 193 dogs in 10 kennels were analyzed by Polymerase Chain Reaction (PCR) using three primer pairs of eight previously reported. Results: all isolates were positive for 152, 272, and 794 bp fragments, indicating that they belong to Group 2. Conclusion: this article presents strong evidence based on the new molecular marker used to classify B. canis isolates from Medellín (Colombia) into Group 2. This is a pioneer molecular study on the presence of B. canis in Colombia and it would be interesting to apply this method to characterize the infection epidemiology and explore its domestic clinical dynamics.

Antecedentes: recientemente, las cepas de Brucella canis (B. canis ) fueron clasificadas dentro de dos grupos, Grupo 1 y Grupo 2, de acuerdo a la presencia o ausencia de una deleción de 794 bp en el gen de la polisacárido deacetilasa, respectivamente. En Colombia Brucella canis se aisló por primera vez en 2005 de perros seropositivos, enfermos o clínicamente sanos. Objetivo: determinar el genotipo de aislamientos de Brucella canis provenientes del Area Metropolitana de Medellín. Método: 49 aislamientos de un estudio con 193 perros en 10 criaderos fueron sometidos a tres Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) simple, empleando 3 pares de cebadores de 8 previamente reportados. Resultados: todos los aislamientos amplificaron los fragmentos de 152, 272 y 794 bp, indicando que pertenecen al Grupo 2. Conclusiones: este artículo presenta evidencia sólida para clasificar las cepas de Brucella canis aisladas en Medellín (Colombia) en el Grupo 2, basado en el uso del nuevo marcador molecular. Este es un estudio molecular pionero de B. canis en Colombia y sería interesante aplicar este método para caracterizar la dinámica epidemiológica y clínica de la infección en el país.

Antecedentes: atualmente, as cepas de Brucella canis foram classificadas em dois grupos, chamados de grupo 1 e 2, de acordo com a presença de uma deleção de 794 pb em seu genoma. No ano 2005, isolaram-se a Brucella canis pela primeira vez na Colômbia, obtida de cães doentes e soropositivos. Neste artigo descrevem-se a classificação de cepas de B. canis isolados em Medellín (Colômbia), de acordo com a nova norma. Objetivo: determinar o genotipo de isolamentos de Brucella canis a partir de amostras da Área Metropolitana de Medellín. Métodos: neste estudo utilizaram-se 49 isolamentos obtidos de 193 cães de 10 criadouros diferentes, os quais foram submetidos para três analises de Reação em Cadeia da Polimerase PCR simples com a utilização de três pares primers dos anteriormente informados. Resultados: todos os isolamentos analisados amplificaram fragmentos de 152, 272 e 749 pb, comprovando que pertencem ao grupo 2. Conclusões: este artigo apresenta evidencia solida para clasificar as cepas de Brucella canis isoladas em Medellín (Colombia) no grupo 2, baseados no uso do novo marcador molecular. Seria de grande importância que os estudos de epidemiologia molecular ampliarem-se para outras áreas de pesquisa na Colômbia, com a finalidade de seguir os patrões das infecções e fazer as correlações clinicas.

EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DEL Staphylococcus aureus EN LECHE DE VACAS AFECTADAS POR MASTITIS / EVALUATION OF SENSITIVITY AN SPECIFICITY OF MOLECULAR DIAGNOSIS FOR Staphylococcus aureus IN MILK OF COWS AFFECTED BY MASTITIS

Entre los agentes contagiosos que inducen mastitis severas en la vaca, se encuentra el Staphylococcus aureus (S. aureus), de difícil cura bacteriológica y alta resistencia antimicrobiana. Debido a que el cultivo microbiológico de las muestras clínicas, solo ofrece resultado en un 50% de los casos (1) el diagnóstico por PCR es una alternativa. El objetivo de este estudio fue probar si los cebadores descritos por Cremonesi et al. (2) para el diagnóstico de S. aureus, como de buena sensibilidad y especificidad, sirven para ser usados en muestras clínicas. Los resultados demostraron que las siguientes secuencias de nucleótidos como cebadores: F 5' AGC TGT GGA TTG TCC TTT GG 3' y R 5' TCG CTC GCT CAC CTT AGA A 3', para obtener un amplificado de 499 pb no sirven en muestras clínicas por su baja especificidad (62,95%). Se requiere buscar nuevos cebadores que amplifiquen regiones del S. aureus que no se compartan con otras bacterias, en especial aquellas que producen mastitis en vacas productoras de leche.

Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of the infectious agents that induce severe mastitis in cows with a difficult bacteriological cure and high antimicrobial resistance. Because the microbiological culture of clinical samples only shows results in 50% of the cases (Koskinen et al., 2009), diagnostic through PCR is an alternative. The aim of this study was to prove if the primers described by Cremonesi et al. (2006) for the S. aureus diagnosis, with good sensitivity and specificity, could be used in clinical samples too. The results showed that the following nucleotide sequences can be used as primers: F 5' AGC TGT GGA TTG TCC TTT GG 3' and R 5' TCG CTC GCT CAC CTT AGA A 3' in order to obtain a 499 pb enlargemenr are not useful in clinical samples due their low specificity (62.95%). It is required to search new primers to amplify S. aureus regions not shared with other bacteria, especially those cauding mastitis in dairy cows.

Detection and monitoring of mastitis in a Brahman cattle herd located in the Colombian low tropics / Detección y seguimiento de la mastitis en un hato de ganado Brahman en el trópico bajo colombiano / Detecção e monitoramento de mastite em um rebanho de gado Brahman no trópico baixo da Colômbia

En una hacienda de ganado Brahman con 573 vacas de cría, ubicada en el trópico bajo colombiano, se observó que la ganancia de peso de los terneros lactantes se disminuía sin una causa aparente y que varias vacas tenían los cuartos perdidos. Objetivo: realizar una evaluación de la salud de la ubre para determinar la presencia de mastitis subclínica a través del CMT o clínica. Métodos: el seguimiento se hizo en el total de vacas presentes en el hato, se muestrearon 8.460 cuartos, durante 41 meses desde septiembre de 2002 a enero de 2006, con el fin de determinar la evolución de la mastitis en los cuartos afectados. Las vacas que fueron detectadas con mastitis clínica o subclínica moderada o severa, fueron tratadas con uno de cinco antibióticos y luego se determinó el efecto del tratamiento aplicado. Se utilizó la estadística descriptiva y se analizó la evolución de la enfermedad teniendo en cuenta los resultados del CMT en el tiempo. Resutados: para un primer CMT se evaluaron 1,013 vacas; de 4,048 cuartos examinados se encontró que el 17.5% (708 cuartos) se encontraban con algún grado de mastitis, de los cuales 249 (6.1%) presentaban mastitis clínica y mastitis subclínica tipo 3 (49 (1.2%) y 200 (4.9%) respectivamente). Se detectó un cuarto perdido en el 5.68% de las observaciones. Las vacas con mastitis que fueron tratadas se observaron en posteriores CMT hasta determinar su curación completa. Conclusión: se observó un efecto positivo de la utilización del tratamiento antibiótico luego del diagnóstico de mastitis y su posterior evaluación con el CMT en el 77.7% de los casos.

Em uma fazenda de gado bovino com 573 vacas Brahman, localizado na região de trópico baixo da Colômbia foi observado que o ganho de peso de bezerros em lactação foi reduzido sem uma causa aparente e que várias vacas tinham perdido um quarto. Objetivo: foi decidido realizar uma avaliação da saúde do úbere para a presença de mastite clínica e subclínica através do teste de CMT. Métodos: o monitoramento foi realizado no total de vacas do rebanho. 8.460 quartos foram amostrados durante 41 meses (setembro de 2002 até janeiro de 2006) com o propósito de determinar a evolução da mastite no quarto afetado. As vacas que foram detectadas com mastite clínica ou subclínica moderada ou severa foram tratadas com diferentes antibióticos, com posteriores exames para determinar o efeito do tratamento aplicado na perda da quarto. Utilizou-se estatística descritiva e algumas interações foram realizadas para tentar compreender a evolução da doença. Resultados: no inicio do estudo, 1.013 vacas foram avaliadas com o teste do CMT durante o período de amostragem. De 4.048 quartos examinados foram encontrados 708 quartos (17.5%) com algum grau de mastite, dos quais 249 (6.1%) apresentaram mastite clínica e mastite subclínica tipo3 (1.2% e 4.9%, respectivamente). Encontrou-se um 5.68% de quartos perdidos. Vacas com mastite foram tratadas e mais tarde foi realizado o teste de CMT para determinar a sua cura completa. Conclusões: Houve um efeito positivo do uso do tratamento com antibiótico após o diagnóstico da mastite e avaliação posteriores com CMT em 77.7% dos casos.

Estrategia de intervención educativa en enfermedades de transmisión sexual / Educational strategy to prevent STI/HIV/AIDS

Las infecciones trasmitidas sexualmente constituyen un grave problema de salud a nivel mundial, la prevención y promoción de salud rebasa los marcos de la salud para ser un problema y una responsabilidad de todos los sectores de la sociedad. Se realizó un estudio descriptivo de corte transversal en el Consejo Popular Capitán San Luís durante el año 2010, con el objetivo de determinar el nivel de conocimientos sobre estas enfermedades, para diseñar una estrategia de intervención educativa en ITS-VIH/SIDA. El universo estuvo constituido por la población del Consejo Popular antes mencionado y la muestra seleccionada al azar por 136 personas de ambos sexos en las edades comprendidas entre 15 - 49 años. La información se obtuvo a través de la aplicación de un cuestionario, y a partir de los resultados obtenidos, se diseñó la estrategia de intervención educativa. Los resultados fueron llevados a tablas para realizar un análisis. Se aplicó la estadística descriptiva (números absolutos y porcientos). La población estudiada conoce que la principal vía de transmisión de las ITS y el VIH/SIDA son las relaciones sexuales, y reconoce las ventajas del uso del condón, pero sólo un escaso número de la muestra estudiada lo utilizan, lo que coincide con la baja percepción del riesgo que tiene esta población de contraer una de estas enfermedades. Todos estos elementos en cuanto a los conocimientos, actitudes y prácticas, permitió diseñar la estrategia de intervención educativa en ITS y VIH/SIDA con acciones de información, educación y comunicación.

Sexually-transmitted infections constitute a serious health problem throughout the entire world, prevention and promotion of health must go beyond health frameworks to a responsibility of all the sectors of society. A descriptive and cross-sectional study was carried out at "Capitan San Luis" council during 2010 with the purpose of determining knowledge levels about these sexually-transmitted infections to design an educational strategy (STI/HIV/AIDS). The target group involved all the population of the council already mentioned, and the sample 136 that was taken at random having both sexes, including people from 15 to 49 years old. The information was collected by means of the application of a questionnaire, designing an educational strategy from the results obtained, showing these results in tables to be analyzed by means of the descriptive statistics (absolute numbers and percentages). The population under study knew the main transmission ways of STI/HIV/AIDS, mainly through sexual relations; they recognized the benefits of condoms, but only a few of the sample under study use them, which matched with the low risk perception this population showed concerning these transmittable diseases. All these elements, regarding knowledge, attitudes and practices, allowed the design of an educational strategy to prevent STI/HIV/AIDS with information, education and communication actions.

Protected fat supplementation and energy metabolism in cows during early lactation / Metabolismo energético en vacas durante la lactancia temprana y el efecto de la suplementación con grasa protegida / Metabolismo energético em vacas no início da lactação e o efeito da suplementação com gordura protegida

Milk synthesis in the mammary gland depends on the influx of adequate amounts and proportions of nutrients. During early lactation cows have to coordinate their metabolism to cope with a huge demand for nutrients, particularly glucose production in the liver. Furthermore, an excessive mobilization of non sterified fatty acids (NSFAs) from the adipose tissue occurs during early lactation, representing a significant challenge to liver function. Understanding the complexity of energy metabolism during early lactation is critical for identifying parameters associated with dairy efficiency. Therefore, important research projects are being conducted, exploring the use of rumen protected fats to improve reproductive efficiency of the cow, milk yield, and also milk quality. Modifying the lipid profile of milk and dairy products, could contribute to healthier dietary alternatives for human consumption.

La síntesis de leche en la glándula mamaria depende de que reciba las proporciones y cantidades adecuadas de nutrientes. Las vacas en el inicio de la lactancia deben coordinar su metabolismo para hacer frente al enorme aumento en la demanda de nutrientes y particularmente de glucosa producida en el hígado, además de la excesiva movilización de ácidos grasos no esterificados NEFAS desde el tejido adiposo lo que presenta grandes desafíos para la función hepática. Por lo tanto, la comprensión del metabolismo energético en ésta etapa es muy importante, ya que permite identificar puntos de partida para la modulación de éstos procesos. Por ello, la investigación a nivel mundial está siendo orientada hacia uso de grasas protegidas en rumen con el fin de mejorar la producción, la reproducción y la calidad de la leche cambiando la composición de la grasa láctea para hacerla más saludable.

A síntese de leite na glândula mamária depende das quantidades adequadas de nutrientes recebidos. Vacas no início da amamentação devem coordenar seu metabolismo para lidar com o enorme aumento na demanda de nutrientes, especialmente glicose produzida no fígado, além da mobilização excessiva de ácidos graxos não-esterificados (NEFAS) a partir de tecido adiposo que apresenta maiores desafios para a função hepática. Portanto, o entendimento do metabolismo energético nesta fase é muito importante porque permite a identificação de pontos a modulação desses processos. Portanto, a nível mundial está-se orientando para a pesquisa, na utilização da gordura protegida no rúmen para melhorar a produção, reprodução e qualidade do leite, alterando a composição da gordura do leite para o tornar mais saudável.

Role of stearoyl CoA desaturase on conjugated Linoleic acid concentration in bovine milk: review / Papel de la estearoil CoA desaturasa sobre la variabilidad en los niveles de ácido linoléico conjugado en la leche bovina: revisión / Papel do estereaoil CoA desnaturase na variação dos níveis do ácido linoléico conjugado em leite bovino: Revisão

Interesting health benefits have been attributed to the intake of conjugated linoleic acid, CLA (C18:2 cis9, trans-11), which is the main isomer of linoleic acid, and is present in bovine milk. Among those benefits are: cancer prevention, diminished risk for the onset of type II diabetes and cardiovascular disease, modulation of the immune response, and reduction of preeclampsia risk in primigravid women. Although an adequate nutrition of cows has permitted to increase the amount of CLA in their milk, there is variation in CLA concentrations among cows consuming the same diet. It has been suggested that this variation is due either to changes in the activity of stearoyl CoA desaturase (SCD), changes in the gene expression, or to alterations in the ruminal process of biohydrogenation. Research conducted in semimembranosus muscle and subcutaneous adipose tissue of cattle suggests there are two isoforms of SCD.

Al isómero mayoritario del ácido linoléico, C18:2 cis-9, trans-11 (Ácido Linoléico Conjugado, ALC) en la leche bovina, se le han atribuido propiedades benéficas para la salud humana, entre las que está su efecto en la prevención del cáncer, disminución de los factores de riesgo para la presentacion de diabetes tipo II y de enfermendades cardiovasculares, modulación de la respuesta inmune como también, en la reducción del riesgo de preeclamsia en mujeres primigrávidas. Aunque se ha logrado elevar la concentración de ALC en leche mediante sistemas de alimentación adecuados, existe variabilidad en su concentración para individuos de una misma especie y sometidos a la misma alimentación. Para explicar dicha variabilidad, se ha sugerido que esta se debe a cambios en la actividad de la Estearoil CoA Desaturasa (ECD), de la expresión genética diferencial o a alteraciones en el proceso de biohidrogenación ruminal. Trabajos realizados en músculo semimembranoso y tejido adiposo subcutáneo en bovinos, sugieren la presencia de dos isoformas de la ECD.

Ao isómero maioritário do ácido linoléico, C18:2 cis-9, trans-11 (Ácido Linoléico Conjugado, ALC) no leite bovina, tem-se atribuído propriedades benéficas para a saúde humana, entre as quais estão: seu efeito na prevenção do câncer, diminuição dos factores de risco para a apresentação da diabetes tipo II e de doenças cardiovasculares, modulação da resposta imune, como também, a redução do risco da préeclâmsia em mulheres primigrávidas. Embora tem-se logrado elevar a concentração dos ALC no leite mediante sistemas de alimentação adequados, existe a variabilidade na sua concentração para indivíduos da mesma espécie e submetidos a uma alimentação semelhante. Para explicar a variabilidade, tem-se sugerido que é causada por mudanças na actividade do Estearoil CoA Desaturase (ECD), da expressão genética diferencial ou às alterações no processo de biohidrogenação ruminal. Trabalhos realizados no músculo semimembranoso e tecido adiposo subcutâneo em bovinos, sugerem a presencia de duas isoformas do ECD.

Aislamiento de Brucella canis en un humano conviviente con caninos infectados: informe de un caso / Isolation of Brucella canis from a human sharing her house with infected dogs

Objetivo: Comunicar un caso de bacteriemia, en una mujer conviviente con perros infectados por Brucella canis.Métodos: Previo consentimiento informado de la propietaria, se le tomó una muestra de sangre, para efectuar inmunofluorescencia (IFI), prueba rápida de aglutinación en placa (PARP) y hemocultivo. Resultados: Se aisló la bacteria B. canis del cultivo de la propietaria del criadero, aislamiento confirmado por el Instituto Nacional ANLIS ®Carlos G. Malbran¼ de Argentina. La mujer no presentó ningún síntoma asociado con brucelosis.Conclusiones: Existen riesgos de contaminación con B. canis en personas que están en estrecho contacto con perros infectados.

Objective: To report a case of bacteremia in a woman living in close contact with dogs infected with Brucella canis. Methods: Previous written consent of the woman a blood sample was taken to perform rapid agglutination test, immunofluorescence, and hemoculture. Results: Brucella canis was isolated and the isolation was confirmed by the Instituto Nacional ANLIS ®Carlos G. Malbran¼ from Argentina. The woman did not present any symptoms associated with brucellosis. Conclusion: There is a risk of contamination by B. canis for people keeping tight contact with infected dogs.

Estandarización del manejo y la criopreservación de semen de hembras masculinizadas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) / Padronizar a gestão ea criopreservação de sêmen de fêmeas de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) sob masculinização / Standardization of handling and freezing sperm from masculinized females of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

La demanda de líneas monosexo hembras en la producción de trucha ha incrementado significativamente en los últimos años, por lo que se han desarrollado tecnologías para estandarizar este proceso como el uso de semen de hembras genéticas sometidas a reversión sexual. El objetivo de la presente investigación fue estandarizar la maduración in vitro y la criopreservación de semen de hembras masculinizadas (neomachos XX) de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) como estrategia para producir descendencias 100% hembras de reproductores colombianos. Para la obtención del semen los neomachos fueron sacrificados y el semen recuperado fue sometido a proceso de maduración con plasma seminal de machos normales o plasma seminal artificial. Para la criopreservación del semen se probaron los crioprotectores dimetilsulfóxido 10% y metanol 10%. En el experimento se evaluron la movilidad post maduración y post descongelación y la fertilidad del semen. El proceso de maduración tuvo un efecto significativo sobre el porcentaje de movilidad (p<0.05), al obtener los mejores valores con el plasma seminal artificial (55 ± 10.4% espermatozoides móviles). Los mayores valores de movilidad postdescongelación (29.9 ± 13.3%) al igual que la mejor fertilidad (26.33 ± 7.53%), se registraron con el protocolo de dimetilsulfóxido al 10%.

The demand of monosex female stocks in production of trout has significantly increased during the past years, which has led to develop new technologies to standardize this process. The usage of semen of genetic females submitted to sexual reversion is a good choice. The objective of this research was to develop a methodology to mature in vitro and cryopreserved semen of sex-reversed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) females as strategy to produce lineage 100% Colombian trout female. The semen was directly obtained from the gonads after its surgical extraction of the slaughtered individuals, later it was submitted to maturation process implementing seminal plasma of normal males and artificial plasma. The semen was cryopreserved in two extender dimetyhyl sulfoxide 10% and methanol 10%. Postmaturation, postcriopreservation movility and sperm fertility were evaluated. �Maturation process had a significative effect on movility, the highest movility was obtained with artificial seminal plasma (55 ± 10.4 %). Highest post criopreservation movility (29.9 ± 13.3%) and highest fertility rates (26.33 ± 7.53 %) were obtained with dimetyhyl sulfoxide 10%.

A procura de linhas monosexo fêmeas na produção de trutas tem aumentado significativamente nos últimos anos, de modo tecnologias foram desenvolvidas com a finalidade de padronizar este processo como o uso do esperma de genética feminina submetido a reversão sexual. O objectivo do presente inquérito foi para uniformizar a maturação in vitro e criopreservação de sêmen masculinização de fêmeas (neomachos XX) trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) como uma estratégia para produzir descendentes de 100% do sexo feminino dos jogadores colombianos. Para a obtenção do esperma neomachos foram mortas e sêmen foi recuperado submetida a maturação processo normal de plasma seminal plasma seminal masculina ou artificiais. Para a criopreservação de sêmen foi testado crioprotectores dimethylsulphoxide 10% e 10% de metanol. O experimento foi evaluron mobilidade pós maturação e pós descongelamento e fertilidade do sêmen. O processo de maturação teve um efeito significativo sobre a porcentagem de mobilidade (p<0.05), para obter os melhores valores com artificial seminal plasma (55 ± 10.4% esperma). Os maiores valores de mobilidade postdescongelación (29.9 ± 13.3%), bem como a melhor fertilidade (26.33 ± 7.53%), foram registrados com o protocolo de dimethylsulphoxide a 10%.

Simplificación de la fertilización de ovocitos durante la producción in vitro de embriones bovinos / Simplificação da fecundação de oócitos durante produção in vitro de embriões de bovinos / Simplification of oocytes fertilization during in vitro production of bovine embryos

El objetivo de este estudio fue evaluar un nuevo procedimiento de fertilización in vitro (FIV) de ovocitos bovinos, en el cual se omitió la centrifugación de los espermatozoides para los procesos de lavado y selección espermática. Dentro de cada uno de los pozos de los platos convencionales de cuatro pozos (pozos externos) se introdujo un nuevo pozo más pequeño (pozos internos) de aproximadamente 50 μl hecho en material de vidrio (0.3 mm de alto por 0.8 mm de diámetro). El procedimiento consistió en llenar los pozos interno y externo con 700 μl de medio de fertilización, hasta que el pozo interno quedara cubierto de medio, luego se depositaron 10 CCOs por pozo interno; luego 30 μl de semen previamente descongelado se depositaron en el fondo del pozo externo. Después de una hora se removió todo el contenido del pozo externo y se dejó el contenido del pozo interno con el medio y las células germinales por un periodo de incubación de 16 h. Los presuntos cigotos fueron cultivados en medio CR1aa por un periodo de siete días con un cambio de medio a las 72h. Como control, se utilizó un gradiente de Percoll 45-90% para la selección espermática. La tasa de de ovocitos divididos fue de (70.8 vs. 73.1) y la proporción de ovocitos que llegaron al estadio de morúla y blastocisto fue de (18.8 vs. 20.3), respectivamente. Los resultados obtenidos con la nueva propuesta metodológica son similares a los obtenidos con la metodología convencional (p<0.05). Estos resultados indican que ambos métodos producen resultados similares pero la nueva propuesta metodológica permite ahorrar tiempo, es menos laboriosa, consume menos reactivos y permite reducir la manipulación de las células espermáticas con buenos efectos eventuales en el mejoramiento de los procedimientos de reproducción in vitro.

This study was conducted to evaluate an in vitro fertilization (IVF) procedure that avoids the washing-selection-centrifugation of spermatozoa prior to coincubation with oocytes. A special dish was constructed as follows: in the middle of each of the 4-wells of a conventional plastic dish (larger wells), another little (≈50 μl) glass dish (inner well) was placed (0.3 mm-tall x 0.8 mm in diameter), in such a way that when the larger plate was filled with 700 μl of IVF media (Fert–TALP), the inner well was also filled up to overflowing. Ten in vitro matured oocytes were set into the inner well, and 30 μl of thawed semen were placed on the bottom of the outer well. After one hour of incubation, the media from the outer well was removed, and the well with the remaining media and the germ cells, were incubated for 16 hours. Presumptive zygotes were cultured in a CR1aa media for seven days with a culture media replace at 72 h. As a control, a conventional IVF, using the classical 45%-90% Percoll gradient selection, was carried out. The cleavage rates (70.8 vs. 73.1) and the proportion of oocytes reaching morula and blastocyst stages (18.8 vs. 20.3) by the “easy-IVF” were similar to the results obtained by the classical method (p<0.05). These results indicate that the two methods yield similar results but the “easy-IVF” definitely saves time, human effort, reagents, and after all reduces the manipulation of the sperm with eventual good effects in the long run toward improving in vitro reproduction procedures.

O objetivo deste estudo foi avaliar um novo procedimento de fertilização in vitro (FIV) de oócitos bovinos, que foi omitida na centrífuga esperma lavar os processos de seleção e de esperma. Dentro de cada um dos poços pratos convencionais quatro poços (poços externa) um novo bem menor (poços internos) cerca de 50 μl fato em vidro (0,3 mm de altura por 0,8 mm de diâmetro) foram introduziu. O procedimento foi de encher poços interna e externamente com 700 μ l meio de fertilização, até que a fossa foi coberto por meios internos e, em seguida, depositadas 10 CCOs em poços internos; então 30 μl previamente descongelados sêmen foi depositado no fundo da cova fora. Depois de uma hora é retirada a todo o conteúdo da cova, e foi deixada fora da doméstica no conteúdo do bem com o ambiente e células germinativas por um período de incubação de 16 h. A alegada zygotes foram cultivados em meio CR1aa por um período de 7 dias com uma mudança no meio-72h. Como um controle, utilizado uma gradiente de Percoll 45-90% de selecção de espermatozóides. A taxa de oócitos foi dividida (70.8 vs 73.1) e da proporção de oócitos que atingiu o estádio e foi Mórula blastocisto (18.8 vs 20.3), respectivamente. Os resultados obtidos com a nova metodologia proposta são semelhantes aos obtidos com a metodologia convencional (p<0.05). Estes resultados indicam que ambos os métodos produzem resultados semelhantes, mas a nova proposta metodológica economiza tempo, é menos trabalhoso, consome menos reativo e reduzem a manipulação de células espermáticas com bons potenciais efeitos na melhoria dos procedimentos reprodução in vitro.

MODELO TEÓRICO PARA EXPLICAR LA ACUMULACIÓN DE GOTAS LIPÍDICAS EN EMBRIONES BOVINOS MACHOS O HEMBRAS PRODUCIDOS in vitro Theoretical Model For Explaining Accumulation Of Fat Drops In In Vitro Produced Bovine Embryos

La glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), codificada por un gen ubicado en el cromosoma X, es la enzima limitante de vía de las pentosas fosfato (PF). La entrada de la glucosa así como su flujo y el rendimiento metabólico de esta vía están determinados tanto por los mismos niveles glucosa así como por la actividad de la G6PD. Por esta vía, la glucosa regula la trascripción de varios genes lipogénicos. En algunos embriones hembra producidos in vitro, se registra un retardo en la normal inactivación de uno de sus cromosomas X, lo cual se traduce en una doble actividad de los genes allí ubicados, si se compara con los embriones macho producidos in vitro. Se postula entonces que, la sobre-regulación de la vía PF a consecuencia de la doble dosis de su enzima limitante (G6PD) y en presencia de elevados niveles de glucosa (mayores a 2,5 mM en el medio de cultivo), conllevaría a un dimorfismo sexual en relación con la transcripción de los genes Acetil CoA Carboxilasa Alfa (en adelante ACACA, símbolo oficial de la acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha), y la Sintetasa de Ácidos Grasos (en edelante FASN, símbolo oficial de la fatty acid synthase) que corriente abajo codifican para las enzimas limitantes en la síntesis de lípidos. Este dimorfismo sexual para el fenotipo metabolismo de lípidos, derivaría en una mayor acumulación citoplasmática de gotas lipídicas en los embriones hembra en comparación con los embriones machos que, de ser así, tendría efectos expansivos sobre el metabolismo general, la actividad transcripcional de otros genes y sobre la resistencia a la criopreservación.

The encoding gene for glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is located on chromosome X. This enzyme regulates the entrance of glucose into the pentose phosphate pathway (PPP). Besides, throughout this route, glucose regulates the transcription of some lipogenic genes. Compared with in vitro produced male embryos, and due to a delaying in X-chromosome inactivation as a consequence of in vitro culture conditions, some early female embryos show two-fold increase in this enzyme (G6PD) and consequently in PPP. It is postulated therefore that this kind of failures in genetic dosage compensation, and in a dependent manner of glucose levels, would generates a sexual dimorphism in lipid metabolic phenotype, at the level of transcription of genes associated to rate limiting enzymes of the synthesis of lipids such as Acetyl-CoA Carboxylase-Alpha (ACACA) and Fatty Acid Synthase (FASN). This would lead to a higher cytoplasmic accumulation of lipid droplets in female embryos with effects on their general metabolism, transcriptional activity of some down stream genes and on their cryotolerance.

Efecto de la variación en el peso y la condición corporal, y la expresión de receptores de leptina y hormona luteinizante, sobre la anovulación posparto en vacas cebú (Bos indicus) / Effect of variation of body weight and body condition and leptin and luteinizing hormone receptor expression, on postpartum anovulation of zebu (Bos indicus) cows / Efeito das variações de peso e condição corporal, de lá expressão de receptores de leptina e hormôna luteinizante, na anovulação pós parto em vacas zebu (Bos indicus)

En este estudio, se analizó la relación de la variación de peso corporal (PC) y de condición corporal (CC), con el tiempo de aparición de los primeros folículos dominantes (FD) y, la presencia de receptores de leptina y de LH en los ovarios. En once vacas cebú se realizó ultrasonografía ovárica durante el posparto para determinar su dinámica folicular: tan pronto como el tercer folículo dominante (FD) fue detectado, las vacas fueron tratadas con LH (FDLH, n = 4) o solución salina (grupo control, FDSS, n = 4) y, 48h después, fueron sometidas a ovariectomía para determinar receptores de leptina y de LH por inmunofluorescencia indirecta (IFI) e immunohistoquímica (IHQ). Las vacas del grupo de control que no presentaron FD también fueron ovariectomizadas (n = 3). No se encontró ningún efecto significativo del PC y la CC sobre los días al tercer FD. Sin embargo, se halló una correlación negativa entre la pérdida de PC y la pérdida diaria de CC y el tiempo al primer y tercer FD. En el grupo FDLH, el 75% (3/4) de las vacas tratadas, ovularon, mientras que en el grupo FDSS, ninguna ovuló. La IFI no fue técnicamente posible, ya que se encontró autofluorescencia en los tejidos. En la IHQ para ambos receptores, se encontró un patrón de expresión similar durante el desarrollo folicular (lo que sugirere una comodulación en el ovario), cuya expresión fue mayor en los FD y en cuerpos hemorrágicos y menor en folículos en crecimiento, tanto en las células de la granulosa, como de la teca y en células luteinizadas.

This study seek for the relationship between body weight (BW) and body condition, the time of appearance of first dominant follicles (DF) and the presence of leptin and LH receptors in the ovaries. Ovarian ultrasonography was performed during the postpartum period on eleven Zebu cows to monitor their follicular dynamics. When the third DF was detected, the cows were treated with LH (n=4) or saline solution (n=4) and 48h later they were ovariectomized to determine leptin and LH receptors by indirect immunofluorescence (IFI) and immunohistochemistry (IHQ). Cows that did not display DF were also ovariectomized (control, n=3). No significant effect of variation of BW and BC on the days to third DF was found. There was also a negative correlation between BW loss and daily BW loss with the time to the first and third DF. In FDLH group, 75% (3/4) of cows, ovulation was induced. In FDSS group, cows did not ovulate. The IFI studies for leptin and LH receptors detection were technically impossible due to the presence of autofluorescence. In the IHQ studies for both receptors, pattern of expression similar during the follicular development was found suggesting a comudulation at the ovarian level, being greater in hemorrhagic bodies and dominant follicles, and minor in growing follicles, at granulosa, theca and luteinized cells levels.

Neste estudo, analisaram a relação entre a variação no peso corporal (PC) ea BCS (CC), com o tempo de aparecimento dos primeiros folículos dominante (FD), e na presença de leptina e receptores de LH ovários. Em onze vacas zebus foi realizado durante o pós parto ultra-som para determinar a sua dinâmica folicular: logo que o terceiro folículo dominante (FD) foi detectado, as vacas foram tratadas com LH (FDLH, n = 4) ou soro fisiológico (grupo controle, FDSS, n = 4) e 48 horas mais tarde, veio a determinar nos termos ovariectomía receptores de leptina e LH por imunofluorescência indireta (IFI) e immunohistoquímica (IHQ). Vacas no grupo de controlo que não apresentarem FD também foram ovariectomizadas (n = 3). Nós não encontramos qualquer efeito significativo sobre o PC do CC no dia de terceiro FD. No entanto, encontramos uma correlação negativa entre a perda do PC e da perda diária de CC e da hora em primeira e terceira FD. Do grupo FDLH-tratados, 75% (3/4) vacas ovularam. Do grupo FDSS, nenhum ovo. O IF não era tecnicamente possível, uma vez que autofluorescencia foi encontrada nos tecidos. No IHQ para ambos os receptores, foi encontrado um padrão semelhante de expressão durante o desenvolvimento folicular sugerindo uma comodulación no ovário, cuja expressão foi maior no DF e corpo hemorrágico nas instâncias inferiores e de folículos em crescimento, tanto nas células granulosa, como nas células da teca e células luteinizadas.

Efecto de la centrifugación sobre la membrana plasmática y el ADN de espermatozoides bovinos / Efeito da centrifugação sobre a membrana plasmática e o DNA de espermatozóides bovinos / Effect of centrifugation on plasma membrane and DNA of bovine spermatozoa

El objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugación realizada en el proceso de lavado y selección. Los espermatozoides fueron sometidos a diferentes tiempos de centrifugación (10, 30 y 45 min); se utilizó un control negativo con espermatozoides no centrifugados y un control positivo con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con peroxido de hidrógeno (H2O2) (200 μM). Para evaluar la integridad de la membrana se utilizó la prueba hipoosmótica (HOST) y para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el ensayo cometa: El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Fisher. La centrifugación durante 10, 30 y 45 min, presentó un efecto estadísticamente significativo sobre el daño en el ADN, respecto de los espermatozoides no centrifugados (p<0.05). Además, se observó diferencia estadística significa (p<0.05) entre los espermatozoides centrifugados a diferentes tiempos con respecto al control positivo realizado con H2O2 (200 μM). La comparación de medias no indicó diferencia estadística significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min (p>0.05) en la reacción positiva a la prueba HOST, lo cual sí sucedió (p<0.05) al comparar los no centrifugados y los centrifugados por 45 min. El control positivo realizado con H2O2 presentó diferencia significativa (p<0.05) con el resto de los tratamientos. En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides durante 10, 30 ó 45 min a 700 x g para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática.

O objetivo de este estudo foi determinar se a integridade da membrana plasmática e o DNA dos espermatozóides podem ser afetados pela centrifugação realizada no processo de lavado e seleção. Os espermatozóides foram submetidos a diferentes tempos de centrifugação (10, 30 e 45 min); foi utilizado um controle negativo com espermatozóides não centrifugados e um controle positivo com espermatozóides submetidos a estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio (H2O2) (200 μM). Para avaliar a integridade da membrana foi utilizado o teste hipoosmótica (HOST) e para avaliar a fragmentação do DNA Fo utilizado o ensaio cometa: A análise estatística se realizou mediante o teste de Fisher. A centrifugação durante 10, 30 e 45 min, apresentou um efeito estatisticamente significativo sobre o dano no DNA, em relação aos espermatozóides não centrifugados (p<0.05). Além disto, observou-se diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os espermatozóides centrifugados a diferentes tempos em relação ao controle positivo realizado com H2O2 (200 μM). A comparação de medias não detectou diferença estatisticamente significativa entre os espermatozóides não centrifugados e os centrifugados por um período de 10 e 30 min (p>0.05) na reação positiva à prova HOST, o qual ocorreu ao comparar os não centrifugados e os centrifugados por 45 min (p<0,05). O controle positivo realizado com H2O2 apresentou diferença significativa (p<0.05) quando comparado contra os outros tratamentos. Em conclusão, os resultados do presente trabalho sugerem que a centrifugação dos espermatozóides durante 10, 30 ou 45 min a 700 x g para realização do gradiente diferencial de percoll, têm um efeito deletério sobre o DNA dos espermatozóides bovinos e que a centrifugação por 45 min além de causar dano no DNA produz perda da integridade da membrana plasmática.

The aim of this study was to evaluate the effects of different times of centrifugation on plasma membrane integrity and DNA of bovine sperm cells, by means of the hyposmotic test (HOST) and the comet assay, respectively. The sperm cells were centrifuged at 700 x g for 10, 30 or 45 min. No-centrifuged thawed semen served as negative control whereas hydrogen peroxide (H2O2) (200 mM) treated sperm cells were used as a positive control. The results indicate that while the integrity of the plasma membrane was not affected by centrifugation, bovine sperm DNA was damaged independently of centrifugation times. Significant differences between negative control and treatments were found (p<0.05) and in the same way, between treatments and positive control, where the damage for oxidative stress was greater. These results indicate that centrifugation could be detrimental for in vitro bovine embryo production. Additionally, some grade of DNA fragmentation in not centrifuged sperm cells (negative control) was registered, suggesting that DNA of bovine sperm cells could be affected by other factors, probably freezing procedure.

Efecto de la suplementación con alanina y glicina sobre los clivajes iníciales de embriones bovinos producidos in vitro / Effect of supplementation with alanine and glicyne on the initial cleavages of bovine embryos produced in vitro

Objetivo. Determinar el efecto de la suplementación con alanina y glicina en el medio de cultivo sobre el porcentaje de clivaje de embriones bovinos, bajo condiciones de alta (20%) y baja (7%) tensión de oxígeno. Materiales y métodos. Los embriones fueron producidos a partir de oocitos madurados in vitro en M-199 suplementado con hormonas e inseminados con semen criopreservado; los cigotos fueron cultivados en medio CR1-AA. Al momento del cultivo se adicionaron alanina y glicina (5 mM y 10mM final respectivamente). Se usaron 4 tratamientos (T1: aminoácidos y baja tensión de oxígeno; T2: aminoácidos y alta tensión de oxígeno; T3: no aminoácidos y baja tensión de oxígeno; T4: no aminoácidos y alta tensión de oxígeno). El clivaje fue evaluado a las 48 hpi (horas post inseminación) evaluándose el número de embriones clivados sobre el total de embriones cultivados y el estadío de desarrollo (no clivados, 2, 4, 5-8 células). Se usó el programa estadístico STATISTICA (versión 5.0). Resultados. El porcentaje de embriones de 5-8 células en el tratamiento 1 respecto a los otros 3 tratamientos fue mayor (p= 0.007). Conclusiones. Los aminoácidos alanina y glicina son fundamentales para los clivajes iniciales y en bajas tensiones de oxígeno se aumenta la proporción de embriones competentes hasta las 48hpi.

Efecto del co-cultivo sobre el desarrollo temprano de embriones bovinos producidos in vitro / Co-culture effect on early development of in vitro bovine embryos

Objetivo. Estudiar el efecto del cocultivo con células oviductales sobre el porcentaje de clivaje 48 horas post inseminación (hpi) de embriones bovinos en bajas tensiones de oxígeno. Materiales y métodos. Se recolectaron ovarios de matadero para la extracción de los ovocitos que fueron puestos en medio TCM 199 suplementado con hormonas, se fertilizaron con semen criópreservado y se cocultivaron en medio CR1aa con células de oviducto durante 48 horas. Se evaluó el porcentaje de clivaje total y el porcentaje de clivaje por estadios de 2-4 células y 5-8 células. La viabilidad de las células para el cocultivo se determinó por observación del movimiento ciliar y observación de monocapa. Los tratamientos fueron T1: células de oviducto + oxígeno 20%; T2: células de oviducto + oxígeno 7%; T3 y T4 fueron controles sin células para ambas concentraciones de oxígeno. Resultados. En cuanto al porcentaje de clivaje no hubo diferencia significativa entre los cuatro tratamientos, pero hubo una tendencia a mayor clivaje para los embriones cocultivados con células y 20% oxígeno. Conclusiones. La utilización de altas tasas de oxígeno (20%) en los sistemas de cococultivo con células oviductales tienden a mejorar los porcentajes de clivaje a las 48 hpi.

Effect of some ions on sperm activation in Brycon henni(Eigenmann 1913)

Spermatozoa in Characid fish remain immobile in seminal plasma and are activated when freed into water where the ionic balance seems to be the main factor starting the activation process. This process was the target of the present study with emphasis on the activation of motility and on motility maintenance over time. The effect of isosmotic solutions was analyzed taking into account the possible combinations of the following ions, Ca2+, K+, Mg2+ and Na+ as well as the effect of channel blocking agents. The parameters measured were cells with motility (per cent), duration of motility (s), plasma membrane potential, and the effect of channel blockers on activation time and on motility. There was an increased motility when the semen was incubated in solutions containing K+ (p<0.05) compared with the control (CaNaMgK solution); the longest duration of motility was attained when the incubation was performed in solutions containing Na+ and Mg2+ (p<0.05). All solutions induced a change in membrane potential detected after 15 s of activation. Blocking K+, Ca2+ and Na+ channels did not alter motility but decreased the activation time (p<0.05). Potassium induced activation at all concentrations up to 105 mM, but motility was drastically decreased at concentrations higher than 140 mM (p<0.05). The conclusion is that interaction of the ionic environment with the cell membrane leads to changes in membrane potential and intracellular signalling that trigger sperm motility in Brycon henni.